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        通過(guò)冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過(guò)程

        更新時(shí)間:2024-11-22   點(diǎn)擊次數:455次

         

        通過(guò)冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過(guò)程

         

        摘要

        原料藥 (DS) 的冷凍是一項關(guān)鍵的單元操作,可能會(huì )影響產(chǎn)品質(zhì)量,可能導致蛋白質(zhì)聚集和不可見(jiàn)顆粒的形成。冷凍濃縮已被確定為影響冷凍期間蛋白質(zhì)穩定性的關(guān)鍵參數,因此應盡量減少。宏觀(guān)冷凍濃縮(以下僅稱(chēng)為冷凍濃縮)主要受冷凍速率的影響,而冷凍速率又受獨立于產(chǎn)品的工藝參數的影響,例如 DS 容器、其大小和填充水平以及冷凍設備。(大規模)工藝特性研究對于理解和優(yōu)化冷凍工藝至關(guān)重要。然而,評估冷凍濃縮需要對冷凍塊進(jìn)行取樣,這通常是通過(guò)將冰塊切成碎片進(jìn)行后續分析來(lái)完成的。此外,這些研究對大量產(chǎn)品的需求是一個(gè)主要限制。在這項研究中,我們報告了一種簡(jiǎn)單的方法的開(kāi)發(fā),該方法使用替代溶液在相關(guān)規模上對瓶中的冷凍 DS 進(jìn)行實(shí)驗表征。新型冰芯取樣技術(shù)確定中心的軸向冰芯可指示低溫濃縮,低溫濃縮通過(guò)滲透壓和組氨酸與聚山梨醇酯 80 (PS80) 的濃度來(lái)測量,而滲透壓則顯示是一種靈敏的讀數。最后,我們通過(guò)比較不同冷凍方案(-80°C vs -40°C)的低溫濃縮來(lái)舉例說(shuō)明該方法研究 DS 瓶中低溫濃縮的適用性。冷凍過(guò)程中的延長(cháng)應激時(shí)間與 2 L DS 瓶軸向中心滲透壓量化的更高程度的低溫濃縮相關(guān)。

        關(guān)鍵詞 低溫濃縮 · 藥物瓶 · 冷凍保存 · 大規模冷凍 · 工藝表征

         

        介紹

        在生物制藥制造中,原料藥(DS) 通常以批量方式冷凍,以提高儲存穩定性并大程度延長(cháng)保質(zhì)期。儲存的目標冷凍溫度通常為 -20°C、-40°C 或 < -65°C,并且不同公司的冷凍/解凍 (F/T) 設備、規程和目標溫度可接受范圍通常不同。冷凍 DS 可以長(cháng)期穩定 DS,降低生物負荷控制(因此為非無(wú)菌)DS 中任何潛在微生物生長(cháng)的風(fēng)險,并避免 DS 和藥物產(chǎn)品 (DP) 的累積穩定性。此外,冷凍 DS 還可以將 DS 與 DP 制造分離,同時(shí)提高 DP 生產(chǎn)的靈活性。另一方面,生物 DS 的冷凍和隨后的解凍可能會(huì )引發(fā)物理不穩定性,這可能會(huì )影響產(chǎn)品質(zhì)量,導致蛋白質(zhì)聚集和顆粒。為了減少 F/T 相關(guān)壓力和對產(chǎn)品質(zhì)量的潛在影響,需要了解 F/T 操作,以充分設計和控制這些關(guān)鍵工藝步驟。

        冷凍過(guò)程尤其會(huì )對產(chǎn)品穩定性產(chǎn)生不利影響。已發(fā)現各種應力條件可能會(huì )在冷凍過(guò)程中破壞蛋白質(zhì)制劑的穩定性,包括冰/液界面處的表面誘導降解以及與冷凍濃縮(也稱(chēng)為冷凍濃縮)相關(guān)的不同條件。微觀(guān)冷凍濃縮是指溶質(zhì)在冰晶之間微觀(guān)空間中的必然濃縮,而宏觀(guān)冷凍濃縮則描述了溶質(zhì)在宏觀(guān)層面(厘米級)上的運輸。

        宏觀(guān)冷凍濃縮發(fā)生在溶液冷凍過(guò)程中,此時(shí)溶質(zhì)被排除在不斷增長(cháng)的冰之外并逐漸濃縮,導致在達到玻璃化轉變溫度 (Tg’) 之前達到最大冷凍濃度,即整個(gè)系統凝固。這種宏觀(guān)冷凍濃縮(下文中將簡(jiǎn)稱(chēng)為冷凍濃縮)可能通過(guò)不同的機制導致蛋白質(zhì)制劑不穩定,包括輔料結晶可能導致 pH 值變化、離子強度增加以及緩沖劑與蛋白質(zhì)之間的特定比例變化。值得注意的是,導致蛋白質(zhì)不穩定的各種冷凍相關(guān)降解機制是配方和蛋白質(zhì)有的,通常無(wú)法相互區分。盡量減少冷凍濃縮,從而在冷凍期間和冷凍后實(shí)現更均勻(同質(zhì))的濃度分布是可取的,這也被認為有利于蛋白質(zhì)穩定性。

        最重要的是,冷凍濃縮受多個(gè)產(chǎn)品和配方獨立工藝參數的強烈影響,例如冷凍設備、容器類(lèi)型、幾何形狀和填充水平。這是因為這些參數會(huì )影響冷凍速率和冷凍方向。因此,可以獨立于活性藥物成分 (API) 進(jìn)行表征冷凍濃縮的工藝特性研究,例如通過(guò)使用替代配方。建議在代表性配置和規模下進(jìn)行研究,即在 DS 瓶中。冷凍對產(chǎn)品質(zhì)量的影響,即研究產(chǎn)品相關(guān)參數,可以在模擬所需低溫濃縮的合適小規模模型中進(jìn)行,因為大量 DS材料的可用性通常是制造規模工藝特性研究的主要限制。

        無(wú)論使用何種冷凍工藝和設備,都必須很好地表征該工藝,以便理想地使用不同的冷凍和解凍速率。與 DS 袋不同,由于缺乏市售的活性 F/T 系統,以及在擴大規模過(guò)程中與幾何相關(guān)的工藝挑戰,DS 瓶中的控制冷凍尤其具有挑戰性。簡(jiǎn)而言之,增加瓶子尺寸會(huì )導致表面與體積比降低,這會(huì )嚴重影響熱交換,減慢冷凍過(guò)程并可能增加冷凍濃縮。因此需要很好地了解不同規模的冷凍過(guò)程。

        與 F/T 研究不同,在 F/T 研究中可以在冷凍和解凍后甚至在多次 F/T 循環(huán)后收集和分析液體樣品,而冷凍過(guò)程本身的表征需要對冰塊進(jìn)行取樣,以便分析冷凍狀態(tài)下的冷凍濃度。這些冷凍取樣程序通常費力且耗時(shí),需要特定工具將冰塊切成隨后可進(jìn)行分析的碎片。先前的研究通常使用帶鋸切割冰塊,而其中一些研究還報告了與這些程序相關(guān)的具體挑戰 [31–33],總體而言,此類(lèi)研究通常僅包括少數實(shí)驗條件和很少或沒(méi)有實(shí)驗重復。

        與之前專(zhuān)注于蛋白質(zhì)穩定性的冷凍研究相比,我們開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速的方法來(lái)研究冷凍狀態(tài)下的低溫濃縮并評估與產(chǎn)品無(wú)關(guān)的工藝參數,例如冷凍設備、冷凍機類(lèi)型、冷凍目標溫度、容器類(lèi)型、容器大小等。在本研究中,我們提出了一種新穎的采樣技術(shù),通過(guò)冰芯鉆孔結合替代溶液的使用,可以表征 DS 瓶中的冷凍過(guò)程,從而確定進(jìn)一步研究的關(guān)鍵工藝參數。取樣從 DS 瓶的頂部進(jìn)行,并進(jìn)一步優(yōu)化,以通過(guò)僅取樣相關(guān)位置來(lái)減少取樣工作量。替代溶液中溶質(zhì)的低溫濃縮程度通過(guò)滲透壓、組氨酸和 PS80 含量來(lái)量化。為了舉例說(shuō)明該方法,我們比較了在 -40°C 與 -80°C 靜態(tài)冷凍條件下 2 L DS 瓶中的低溫濃度,以證明區分不同冷凍方案的適用性。

         

        材料和方法

        樣品制備

        制備了代表標準單克隆抗體 (mAb) 配方的替代溶液,該替代溶液包含 20 mM L-組氨酸緩沖液、240 mM 蔗糖、10 mM L-蛋氨酸和 0.04% 聚山梨醇酯 80 (PS80),pH 值為 5.5(Tg’ -34°C,~ 1.3 cP)。L-組氨酸、L-組氨酸 HCl、L-蛋氨酸和 PS80(J.T. Baker)從 VWR(瑞士迪提康)購買(mǎi),蔗糖從 Pfanstiehl(瑞士祖格)購買(mǎi)。使用從 VWR(瑞士迪提康)購買(mǎi)的 0.22 µm PVDF 過(guò)濾器對制備的替代溶液進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。

        將 2 L 替代溶液裝入 SaniSure(盧森堡巴沙拉日)提供的 2 L 聚碳酸酯 PharmaTainer™ 瓶中,并在 Thermo Fisher Scientific(美國北卡羅來(lái)納州阿什維爾)的 -80°C 超低溫 (ULT) 冰箱 Revco™ (RDE50086FV) 或 Snijders Labs(荷蘭蒂爾堡)的 -40°C 低溫冰箱 (VF360-45G) 中被動(dòng)冷凍。

        在開(kāi)始實(shí)驗運行之前,將單個(gè) DS 瓶放置在空冰箱底架的中央,并將門(mén)打開(kāi)時(shí)間為 1 分鐘。

         

        Ice Core Sampling 冰芯取樣

        如圖 1 所示,使用冰芯鉆孔技術(shù)對冷凍取樣獲得的樣品進(jìn)行冷凍后溶液成分的低溫濃縮分析。

        連續使用兩種不同的設置。第一種設置每瓶收集三個(gè)軸向冰芯(圖 1a)進(jìn)行橫截面分析。對于邊緣(E)和半徑向距離(H)冰芯位置的取樣,在冷凍前將瓶子的上部切掉并用膠帶緊緊封閉。優(yōu)化的設置(圖 1b)僅通過(guò)瓶口收集瓶子徑向中心的冰芯。頂部的第一個(gè)樣品總是用直徑為 21 毫米的不銹鋼手動(dòng)取芯器手動(dòng)取出,取樣深度約為 20 毫米,以標記后續機器鉆孔的位置。

        為了在冰芯中鉆孔,將瓶子緊緊固定在虎鉗中,并使用配備不銹鋼芯鉆(內徑:16 毫米,外徑:21 毫米,長(cháng)度:200 毫米)的電鉆機(SFS Group,瑞士 Heerbrugg)進(jìn)行鉆孔,該鉆機來(lái)自 Bürkle GmbH(德國巴特貝林根)。使用樣品彈出器附件將冰芯從空心芯鉆中輕輕取出,并放置在干凈的工作表面上,預先標記好 25 毫米的部分(圖 1c)。將樣品分離并轉移到試管中進(jìn)行解凍,并從底部開(kāi)始編號。由于冷凍后在冷凍塊中心存在冰山,因此收集的樣品數量從 11 到 13 不等。此外,由于瓶子中心的凹形,H 和 E 軸上的鉆孔深度略深。為了消除采樣程序(開(kāi)放式處理)中潛在的外部顆粒污染,樣品解凍后用 5.0 µm PVDF MillexSV 注射器過(guò)濾器(Merck,瑞士 Buchs)進(jìn)行過(guò)濾,然后儲存在 -80°C 下直至分析。

         

        溫度曲線(xiàn)

        在一個(gè)案例研究中,應用兩種不同的冷凍方案,即冷凍至 -80°C(RDE50086FV Revco™ ULT 冷凍機)或 -40°C(VF360-45G 低溫冷凍機),在冷凍過(guò)程中記錄了溫度曲線(xiàn)。

        對于進(jìn)行冰芯鉆探的 DS 瓶,使用 Testo(瑞士門(mén)夏爾特多夫)的 Pt-100 溫度探頭記錄 DS 瓶外部的溫度(見(jiàn)圖 1b)。作為對照,使用相同的溫度映射設置記錄了單獨的對照瓶中的溫度曲線(xiàn),但在液體中放置了額外的 Typ-T 熱電偶(來(lái)自 TC GmbH)(見(jiàn)圖 2),以便將對照瓶的溫度曲線(xiàn)與用于冰芯采樣的瓶子的溫度曲線(xiàn)進(jìn)行比較。通過(guò)比較可以將對照實(shí)驗中估計的應力時(shí)間轉移到用于冰芯鉆探的 DS 瓶中。對于控制溫度測量,將熱電偶放置在第一個(gè)凍結點(diǎn) (FPF) 和最后一個(gè)凍結點(diǎn) (LPF) 處,并使用相同的凍結方案進(jìn)行凍結。對于本研究中使用的配置(被動(dòng)凍結一個(gè)裝滿(mǎn) 2 L 的 2 L DS 瓶),FPF 和 LPF 分別位于邊緣底部和徑向中心,液位高度約為 1.5 L,如先前確定的。

        分析溫度曲線(xiàn),從兩個(gè)獨立的溫度映射實(shí)驗中評估應力時(shí)間的平均值和標準偏差,作為 FPF 處 < 0°C 到 LPF 處 -34°C 之間的時(shí)間跨度,即替代溶液的 Tg'。

         

         

        img1 

         

        圖 1 冷凍 DS 瓶中冰芯取樣技術(shù)和溫度監測示意圖。a 橫截面分析:在不同徑向位置(瓶子的側面和頂視圖)取樣三個(gè)冰芯,即在中心 [C]、半徑向距離 [H] 和邊緣 [E]。b 中心芯分析:通過(guò)瓶口取樣中心芯。溫度探頭連接在瓶子外部,用于在冷凍期間記錄溫度。c 帶有冰芯樣品彈出器的冰芯鉆頭和彈出的冰芯,分成 25 毫米長(cháng)的樣品

        img2 

        圖 2 DS 瓶?jì)鹊臏囟葴y繪裝置示意圖,用于記錄第一個(gè)凍結點(diǎn) (FPF)、最后一個(gè)凍結點(diǎn) (LPF) 和瓶外的溫度

         

        溫度數據由 OMEGA Engineering GmbH(德國 Deckenpfronn)的 RDXL6SDUSB 數據記錄器記錄,并使用 Origin Lab 軟件版本 2023(OriginLab Corporation,美國馬薩諸塞州北安普敦)進(jìn)行評估。

         

        分析方法

        滲透壓

        滲透壓濃度通過(guò)凝固點(diǎn)降低測量,使用 Gonotec 的 Osmomat 3000 儀器,該儀器由 Haslab GmbH(瑞士比爾本肯)訂購。樣品在校準范圍內測量三次,范圍在 0 mOsmol/Kg 和 850 mOsmol/Kg 之間。如果需要進(jìn)行分析,樣品用水稀釋。

         

        PS80 量化

        PS80 通過(guò) Brito & Vaz 描述的 HPLC-熒光膠束測定法進(jìn)行定量分析。簡(jiǎn)而言之,根據 Schmidt 等人的方法測量未稀釋的樣品。使用 Waters Acquity Arc Premier 系統(瑞士巴登)與 Waters 2475 熒光檢測器(瑞士巴登)耦合。使用 0.004% 至 0.1% 之間的校準范圍,如果需要,用水稀釋樣品。

         

        組氨酸定量

        采用毛細管區帶電泳 (CZE) 方法對組氨酸進(jìn)行定量分析,所用設備為 SCIEX PA800plus 系統(Brea;美國),該系統配備有紫外檢測器、214 nm 濾光片(SCIEX)、溫控自動(dòng)采樣器和 30 kV 電源。測量采用 Molex(Lisle;美國)的熔融石英毛細管進(jìn)行,其內徑為 30 µm,長(cháng)度為 20/30 cm。在一個(gè)序列中,樣品儲存在 10°C 的自動(dòng)采樣器中。對于分離緩沖液,使用 150 mM 磷酸鹽溶液(pH 1.5)與 5% IPA 混合。在注入樣品之前,用 1 M HCl、H2O 和背景電解質(zhì)沖洗毛細管,或每次在 50 psi 下沖洗三分鐘。通過(guò)三次標準 CZE 運行和一個(gè)空白,使新鮮的毛細管平衡以適應分離緩沖液條件。分離電壓設定為 +28 kV。使用的校準范圍為 1 至 100 mM 組氨酸,并向每個(gè)樣品中添加 20 mM 4-氨基苯甲酸作為內標。

         

        數據評估

        低溫濃縮分析結果以濃度因子表示,其計算方法是將樣品濃度除以替代溶液的初始濃度。使用 OriginPro 2023 版(OriginLab Corporation,美國馬薩諸塞州北安普頓)對數據進(jìn)行可視化。

        結果與討論

        DS 瓶中的低溫濃度分布圖

        建立了冰芯取樣方法,以研究裝有 2 L 替代溶液的 2 L DS 瓶中的低溫濃縮,該替代溶液代表 mAb 配方。在第一個(gè)設置中(圖 1a),在從三個(gè)軸向冰芯收集的樣品中確定了在 -80°C 下冷凍后 2 L 瓶中溶質(zhì)的分布。滲透壓(圖 3a)被測量為一個(gè)依數參數,代表替代溶液中的組氨酸和蔗糖濃度;組氨酸(圖 3b)被量化為緩沖系統和可能的 pH 平衡的變化指標,PS80(圖 3c)被量化為生物制劑配方中穩定界面應力的關(guān)鍵賦形劑。對于所有三個(gè)測試的配方參數,冷凍本體中的溶質(zhì)分布闡明了朝向冰丘底部中心和頂部的鐘形濃度分布。

        之前在不同研究中觀(guān)察到了溶質(zhì)的鐘形濃度,這些研究采用了類(lèi)似的條件但不同的采樣技術(shù) 。例如,將 mAb 制劑在圓形 1 L HDPE 瓶中冷凍至 -70°C(通過(guò)滲透壓和 mAb 濃度量化)后,其濃度呈鐘形。同樣,對于不同的冷凍方案,Kolhe 及其同事報告了瓶中冷凍的鐘形濃度曲線(xiàn),而冷凍至 -40°C 和 -20°C 產(chǎn)生的冷凍濃縮程度高于冷凍至 -70°C 的瓶子。Duarte 等人 使用了與本研究中介紹的類(lèi)似的裝置。他們將裝滿(mǎn)牛血清白蛋白 (BSA) 溶液的 2 L 矩形 DS 瓶冷凍至 -75°C,但使用了帶有強制空氣對流的干冰室。作者報告稱(chēng),與本文中提出的替代溶液的結果相比,2 L 瓶?jì)鹊?BSA 分布情況相當,并且還發(fā)現,與前面提到的 Kolhe & Badkar 的研究相反,頂部存在高度濃縮的區域 。Padala 等人在 -30°C 的步入式冷凍柜中冷凍 10 L 玻璃瓶中的 8.5 kg BSA 溶液后,分析了 BSA 的低溫濃縮情況,甚至發(fā)現頂部的濃度最高。

         

        img3 

        圖 3 a-c 在 -80°C 冰箱中被動(dòng)冷凍后,2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液的中心核心采樣的代表性橫截面輪廓圖和 d-f 條形圖。數字表示 a、d 滲透壓、b、e PS80 和 c、f 組氨酸的濃度因子。輪廓圖和條形圖使用相同的顏色標度進(jìn)行視覺(jué)比較。對于 d-f,數據表示為兩個(gè)實(shí)驗的平均值±標準差

         

        在停滯空氣條件下(標準 ULT 冷凍機),瓶?jì)缺粍?dòng)冷凍預計會(huì )以從外到內的徑向冷凍幾何形狀發(fā)生,這與冰丘的形成有關(guān)。這些冰丘是由于冷凍過(guò)程中體積膨脹而形成的,這導致因徑向冷凍而滯留在中心的濃縮液體被向上推到頂部。

        除了不在本研究范圍內的配方相關(guān)參數(例如粘度、Tg’)外,已知與工藝相關(guān)的參數(例如冷卻速率、熱流方向、容器幾何形狀和填充水平)對冷凍后溶質(zhì)的分布曲線(xiàn)有重大影響。事實(shí)上,這些參數影響溶質(zhì)的對流質(zhì)量流與被滯留在不斷增長(cháng)的冰中的溶質(zhì)質(zhì)量分數之間的相互作用,這最終決定了冷凍塊中溶質(zhì)的分布。例如,凍結鋒速度首先影響冰鋒的形態(tài),而冰鋒的形態(tài)決定了被困在冰中的溶質(zhì)的質(zhì)量分數;其次,溶質(zhì)離開(kāi)冰鋒的運動(dòng)由液相中的擴散和對流決定。因此,快速凍結被描述為減弱冷凍濃縮的程度。

        總之,鐘形低溫濃度分布被認為是 DS 瓶中典型的徑向和慢速冷凍幾何形狀的結果。僅部分被困在徑向生長(cháng)的冰中的溶質(zhì)被連續輸送到中心,而未凍結液體中的密度梯度(由溫度梯度引起)促進(jìn)自然對流,將溶質(zhì)向下拖拽的速度高于沿徑向中心向上輸送的速度 。容器幾何形狀和熱流方向決定了形成的冰幾何形狀,從而決定了尚未凝固的液體的剩余空間,溶質(zhì)在其中發(fā)生對流運動(dòng)。由于被動(dòng)冷凍 DS 瓶中溶質(zhì)的分布分布是徑向冷凍幾何形狀的結果,因此高濃度區域預計沿垂直軸。

        因此,我們選擇瓶子中的軸心作為分析低溫濃度和優(yōu)化冰芯鉆探裝置 1 的代表區域(圖 1a)。優(yōu)化設置 2(圖 1b)僅從軸心芯收集樣本,其中包括最后凝固的代表性中心區域。在優(yōu)化設置中,冰芯通過(guò)瓶口取樣,如圖 1b 所示,無(wú)需切掉瓶子的頂部。

        與僅分析中心芯的優(yōu)化設置(圖 3d-f)相比,橫截面分析報告的溶質(zhì)濃度(圖 3a-c)產(chǎn)生了類(lèi)似的結果。橫截面分析中的最高濃度位于最底部的中心(位置 1 圖 3d-f),而對于優(yōu)化設置(中心芯分析),最高溶質(zhì)濃度可重復地發(fā)現略高于底部(位置 2 圖 3d-f)。在冷凍過(guò)程中,橫截面分析中瓶子的頂部被切掉并用膠帶固定,這意味著(zhù)瓶子在設置 1 中不是氣密的/壓力密封的。與最終優(yōu)化設置中未經(jīng)操作的瓶子相比,瓶子的操作可能解釋了橫截面分析中最高溶質(zhì)濃度位置的輕微變化。與文獻數據一致,我們的研究結果證實(shí),瓶子中冷凍塊體徑向軸的中心核既反映了濃度熱點(diǎn)(即頂部和底部附近的最大冷凍濃度),也覆蓋了低濃度區域,例如頂部高濃度部分的下方。

        已證明與冷凍過(guò)程相關(guān)的不穩定性是冷凍濃縮產(chǎn)生不均勻冷凍基質(zhì)的結果。在濃度較低的區域、賦形劑和蛋白質(zhì)之間比例發(fā)生變化的區域以及頂部的冰丘區域 都觀(guān)察到了降解。與直覺(jué)相反,這意味著(zhù)蛋白質(zhì)降解通常不會(huì )發(fā)生在冷凍塊中冷凍濃度最高的區域。

        因此,中心核心被認為是預測 DS 瓶中冷凍濃縮發(fā)生的指示性指標,因為它反映了冷凍濃縮的程度,覆蓋了瓶中低濃度和高濃度區域之間的廣泛范圍。然而,對于使用截然不同的冷凍工藝(例如,可能對瓶中的冷凍幾何形狀產(chǎn)生影響,如氣流冷凍機的情況)的瓶子,建議對瓶子進(jìn)行擴展分析,以確認中心軸仍然反映瓶子內相關(guān)的感興趣區域。值得注意的是,通過(guò)瓶子開(kāi)口取樣的中心核心的優(yōu)化設置不需要操縱瓶子,并且大大降低了取樣程序的復雜性和時(shí)間。

         

        不同溶液成分的低溫濃縮

        為了研究冷凍濃縮,我們分析了滲透壓并量化了替代溶液樣品的 PS80 和組氨酸濃度,并將結果報告為濃縮因子。對于兩種采樣裝置的三個(gè)讀數,確定了相似的濃縮因子,如圖 3a-c 和 d-f 所示。定量地看,滲透壓和組氨酸的趨勢產(chǎn)生了可比的濃縮因子,與 PS80 的濃縮因子相比略高。根據替代溶液的成分,滲透壓主要反映溶液中的組氨酸和蔗糖濃度。

        有趣的是,文獻中的幾項研究報告稱(chēng),配方輔料(例如糖和緩沖鹽)的濃縮程度通常比蛋白質(zhì)更高,這主要歸因于這些分子的不同擴散系數。在 Bluemel 等人的研究中,在含有 PS80 的組氨酸緩沖液中配制的 mAb 在 2 L 瓶中冷凍至 -40°C。對冷凍塊中低溫濃縮的分析表明,與溶液中的 mAb 和 PS80 相比,組氨酸的濃縮程度更高。濃縮程度確實(shí)與這三種成分的測量擴散系數相關(guān)。有趣的是,mAb 和 PS80 的濃縮程度相似,這可以通過(guò) PS80 膠束和 mAb 分子的擴散系數相似來(lái)解釋。然而,不能排除 PS80 作為一種傾向于與表面(冰/液體表面)相互作用的表面活性分子,其行為可能與其他小分子成分不同,但更相似,就像蛋白質(zhì)也是兩親分子一樣。

        其他作者描述說(shuō),對流驅動(dòng)的溶質(zhì)運動(dòng)主導了擴散的影響,因此得出結論,化合物擴散系數的差異可以忽略不計。

        Weber 和 Hubbuch 通過(guò)時(shí)間分辨在線(xiàn)拉曼光譜從機制上研究了溶液中不同成分的低溫濃縮過(guò)程。簡(jiǎn)而言之,凍結前沿剩余液相中溶質(zhì)的質(zhì)量傳輸是分子對流和擴散運動(dòng)之間復雜相互作用的基礎,這種相互作用受上述過(guò)程相關(guān)參數的影響,也受決定分子流動(dòng)性的溶液特性(如其特定的擴散系數和粘度)的影響。

        因此,可以假設溶液中的小分子濃縮到更高的程度,這與本研究通過(guò)單獨觀(guān)察組氨酸濃度或通過(guò)滲透壓作為組氨酸和蔗糖的累積參數觀(guān)察到的結果一致。因此,我們將滲透壓視為一種靈敏的讀數,以研究 DS 瓶中的冷凍濃縮與冷凍過(guò)程的關(guān)系。

        增加粘度可以通過(guò)限制溶液內的自然對流和擴散來(lái)抵消冷凍濃縮的影響,這種影響甚至在冷卻時(shí)會(huì )加劇,正如 Bluemel 等人所展示的那樣。我們還可以使用我們的裝置研究粘度對最終冷凍濃縮的影響。本研究中使用的替代溶液具有相對較低的粘度,代表了一種靈敏的裝置,經(jīng)過(guò)優(yōu)化可研究工藝參數。

        總之,盡管 PS80 的冷凍濃縮可能對蛋白質(zhì)分子具代表性,但為了研究冷凍濃度與冷凍過(guò)程參數的關(guān)系,滲透壓(在我們的配方中主要代表組氨酸和蔗糖)是靈敏的讀數,同時(shí)與單個(gè)成分的含量分析相比,它是一種快速而簡(jiǎn)單的分析方法。

         

        案例分析

        我們采用優(yōu)化的冷凍取樣方法研究了不同冷凍方案(即不同的目標冷凍溫度 -40°C 和 -80°C)下 2 L DS 瓶中替代溶液的冷凍濃縮。

        我們使用傳統的 -40°C 冷凍機故意誘導更長(cháng)的應力時(shí)間,而 -80°C 冷凍由于溫差較低而延長(cháng)了達到 Tg' 以下溫度的時(shí)間跨度。應力時(shí)間是從冰核開(kāi)始到達到 Tg'(冷凍基質(zhì)凝固)的時(shí)間跨度。在此時(shí)間跨度內,液相中的溶質(zhì)不斷濃縮,因此應力時(shí)間可視為冷凍過(guò)程中冷凍濃縮的指標。

        我們根據圖 2 所示的設置通過(guò)溫度映射表征了兩種冷凍方案,并確定了在 -80°C 和 -40°C 下冷凍的應力時(shí)間分別為 4.9 小時(shí)(± 0.2)和 11.2 小時(shí)(± 0.2)。圖 4 顯示了采樣瓶(經(jīng)過(guò)冰芯采樣)外部記錄的代表性溫度曲線(xiàn)和相應溫度。采樣瓶外部記錄的溫度曲線(xiàn)與溫度映射實(shí)驗的相應曲線(xiàn)相匹配,證明了冷凍程序的可重復性,從而證明了用于估計實(shí)際采樣瓶中應力時(shí)間的溫度數據的有效性。

        冷凍濃度通過(guò)滲透壓定量(圖 5)。在 -40°C 下冷凍與在 -80°C 下冷凍相比,產(chǎn)生的濃度曲線(xiàn)不同。在 -40°C 下冷凍的瓶子承受的壓力時(shí)間是其 2 倍多,導致冷凍濃縮程度更高,而且濃縮的底部區域沿著(zhù)中心核心分布在更寬的區域。因此,我們確認冷凍替代溶液的中心核心采樣方法結合滲透壓讀數是一種靈敏的方法,可以表征和區分冷凍方案并研究 2 L DS 瓶中的冷凍濃度。

         

        img4 

        圖 4 在 a -80°C 冰箱和 b -40°C 冰箱中,2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液被動(dòng)冷凍的代表性溫度曲線(xiàn)。記錄了進(jìn)行冰芯采樣的瓶子的溫度曲線(xiàn)(紫線(xiàn)),并將其與對照實(shí)驗記錄的溫度曲線(xiàn)疊加。在相同條件和冷凍方案下冷凍的對照瓶的溫度曲線(xiàn)記錄在瓶子外部(紅線(xiàn)),以及第一個(gè)冷凍點(diǎn) (FPF)(紅色虛線(xiàn))和最后一個(gè)冷凍點(diǎn) (LPF)(紅色虛線(xiàn))

         

        img5 

         

        圖 5 在 -40°C 冰箱中被動(dòng)冷凍后,在 2 L DS 瓶中的 2 L 替代溶液的中心核心中分析的低溫濃縮,顯示為滲透壓的濃度因子

         

        應用和限制

        在本研究中,我們報告了一種便捷方法的開(kāi)發(fā),該方法使用替代溶液在相關(guān)規模上對 DS 瓶中的冷凍過(guò)程進(jìn)行實(shí)驗表征。將所提出的方法與以前報告的采樣技術(shù)進(jìn)行比較,幾乎所有的冷凍研究都采用冷凍采樣,即使用帶鋸將冷凍塊切成小方塊。這些程序通常需要首先將容器與冷凍塊分離,然后沿三維軸逐片切割冷凍塊或從預切切片中取出核心樣本,最終獲得大小相同的樣品塊。在實(shí)踐中,這個(gè)過(guò)程很費力,因此很耗時(shí),并且需要特定的設備和設施。此外,以前報告的程序仍然存在一些挑戰,例如需要預冷鋸片或在切割前將樣品存放在干冰上。此外,根據容器的表面材料,報告稱(chēng)冷凍塊與容器的緊密粘附,這需要例如加熱接觸面以將冰從容器壁上分離。

        然而,所有冷凍采樣技術(shù),包括我們的巖心鉆探技術(shù),都需要開(kāi)放式處理,存在樣品受到外部污染(例如顆粒污染)的風(fēng)險。根據所采用的溶液(替代物或蛋白質(zhì)溶液)和分析方法,應采用適當的樣品制備方法。然而,像本研究中報告的技術(shù)一樣,采用更少的處理步驟并且對 DS 容器本身無(wú)損的采樣技術(shù)最終將減少來(lái)自環(huán)境和過(guò)程的潛在顆粒污染。

        盡管通常沒(méi)有明確提及,但采樣程序本身被認為對結果有重大影響,特別是對冷凍濃縮的程度,通常報告為與初始濃度相比的濃度因子。通過(guò)冷凍采樣確定冷凍濃度在很大程度上取決于采樣冰塊的大小,正如之前提到的。值得注意的是,冷凍采樣方法總是描述宏觀(guān)的,而不是微觀(guān)的冷凍濃縮,因此從冷凍塊中收集的樣品的大小/體積肯定決定了樣品的稀釋程度。例如,在高濃度區域收集的較小尺寸的樣品會(huì )產(chǎn)生更高的最大濃度,這在概念上可以描述為方法的“分辨率"。在數據解釋和實(shí)驗設計中,應考慮這種不可避免的樣本量依賴(lài)性限制。這意味著(zhù),使用不同采樣設置和配置的不同研究的結果不能直接相互比較,并且采樣技術(shù)從冷凍批量中收集相同大小的樣品的能力至關(guān)重要,即使樣本大小的某些變化是不可避免的,例如由于冰結構和成分的變化。本研究開(kāi)發(fā)的技術(shù)通過(guò)仔細選擇鉆井設備的尺寸并隨后分離冷凍樣品,有助于生成小樣本。

        由于冷凍過(guò)程主要由與產(chǎn)品無(wú)關(guān)的工藝參數決定,例如如上所述的容器幾何形狀、尺寸和填充量,因此使用替代品(代替高價(jià)值的蛋白質(zhì)溶液)進(jìn)行工藝表征研究能夠表征冷凍過(guò)程,并允許在相關(guān)的代表性配置和規模(即在 DS 瓶中)下進(jìn)行實(shí)驗表征。使用替代溶液可以進(jìn)行大量獨立于產(chǎn)品的實(shí)驗和各種工藝參數的測試,從而能夠篩選和識別關(guān)鍵工藝參數。根據冷凍研究的目的,可以?xún)?yōu)化替代溶液的性質(zhì),使其與特定產(chǎn)品的性質(zhì)相匹配,或與典型的 DS 溶液的性質(zhì)相匹配。在我們的研究中,我們選擇了一種具有典型配方成分的替代溶液,該替代溶液具有與冷凍濃縮相關(guān)的但最壞情況的性質(zhì)(低粘度和低 Tg'),以生成一個(gè)靈敏的設置來(lái)量化冷凍濃縮。對于以工藝參數為重點(diǎn)的工藝表征,滲透壓是一種簡(jiǎn)單而有代表性的讀數,用于指示替代溶液的冷凍濃縮的發(fā)生。

        由于 DS 材料的可用性通常是制造規模工藝表征研究的主要限制,因此可以在合適的小規模模型中研究冷凍對產(chǎn)品質(zhì)量的影響,這些模型模擬預期濃度,例如在使用替代溶液進(jìn)行相關(guān)規模的補充實(shí)驗中確定的濃度。因此,了解冷凍過(guò)程和過(guò)程參數的相關(guān)性也使得選擇有意義且相關(guān)的條件進(jìn)行小規模產(chǎn)品質(zhì)量測試成為可能。

         

        結論

        冷凍和解凍是生物分子制造過(guò)程中的關(guān)鍵單元操作,必須對其進(jìn)行充分表征以盡量減少其對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

        特別是冷凍過(guò)程可能會(huì )在整個(gè)冷凍 DS 中產(chǎn)生相當大的不均勻性,這與許多不利條件有關(guān),例如賦形劑和蛋白質(zhì)濃度的變化、與自身相互作用傾向的潛在變化相關(guān)的離子強度變化或 pH 值的變化,這可能會(huì )影響聚集體形成和顆粒物等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

        為了研究 DS 瓶中的低溫濃縮,我們報告了一種簡(jiǎn)單的采樣方法,通過(guò)冰芯鉆孔使用滲透壓作為一種快速靈敏的讀數,而不是以前耗時(shí)且復雜的冷凍采樣技術(shù)。我們的方法特別適合表征與產(chǎn)品無(wú)關(guān)的工藝參數,例如比較冷凍設備或冷凍方案,如案例研究中所示。使用替代溶液可以在足夠高的分辨率下篩選制造規模的多個(gè)工藝參數,以便識別關(guān)鍵工藝參數,而無(wú)需大量蛋白質(zhì)溶液。

         

        縮寫(xiě) API:活性藥物成分;BSA:牛血清白蛋白;C:中心;CZE:毛細管區帶電泳;DS:藥物物質(zhì);DP:藥物產(chǎn)品;E:邊緣;FPF:第一個(gè)冷凍點(diǎn);F/T:冷凍/解凍;H:半徑向距離;LPF:最后一個(gè)冷凍點(diǎn);mAb:?jiǎn)慰寺】贵w;PS80:聚山梨醇酯 80;Tg:玻璃化轉變溫度;ULT:超低溫

         


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&#x4E2D;&#x6587;&#x5B57;&#x5E55;&#x65E5;&#x97E9;&#x7CBE;&#x54C1;&#x719F;&#x5973;&#x5C11;&#x5987; &#x6B27;&#x7F8E;&#x53C8;&#x8272;&#x53C8;&#x723D;&#x53C8;&#x9EC4;&#x7684;&#x89C6;&#x9891;&#x5728;&#x7EBF;&#x89C2;&#x770B; &#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;999&#x7CBE;&#x54C1;&#x89C6;&#x9891;&#x7F51;&#x7AD9; &#x4E45;&#x4E45;&#x514D;&#x8D39;&#x770B;&#x9EC4;A&#x7EA7;&#x6BDB;&#x7247;&#x7B49;&#x6700;&#x65B0;&#x5167;&#x5BB9; &#x4E9A;&#x6D32;&#x4E2D;&#x6587;&#x65E0;&#x7801;a&#x2228;&#x5728;&#x7EBF;&#x89C2;&#x770B;&#x82F9;&#x679C;&#x624B;&#x673A;&#x597D; &#x7CBE;&#x54C1;&#x65E0;&#x7801;&#x9ED1;&#x4EBA;&#x53C8;&#x7C97;&#x53C8;&#x5927;&#x53C8;&#x957F; &#x65E0;&#x7801;av&#x4E2D;&#x6587;&#x5B57;&#x5E55;&#x4E45;&#x4E45;av&#x89C6;&#x9891;.&#x63D0;&#x4F9B;&#x5C9B;&#x56FD;&#x4E00;&#x7EA7;&#x514D;&#x8D39; &#x5348;&#x591C;&#x5728;&#x7EBF;&#x89C6;&#x9891;&#x56FD;&#x4EA7;&#x6781;&#x54C1;&#x7247; &#x56FD;&#x4EA7;&#x514D;&#x8D39;&#x4E00;&#x533A;&#x4E8C;&#x533A;&#x4E09;&#x533A;&#x514D;&#x8D39;&#x89C6;&#x9891; a&#x7EA7;&#x6BDB;&#x7247;&#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;&#x4E45;&#x7CBE;&#x54C1;&#x5728;&#x7EBF;&#x89C6;&#x9891;&#x6700;&#x65B0; &#x4E45;&#x4E45;&#x5F3A;&#x5977;&#x4E71;&#x7801;&#x8001;&#x719F;&#x5973;&#x7F51;&#x7AD9;&#x62E5;&#x6709;&#x6570;&#x767E;&#x4E07;&#x89C6;&#x9891;&#x521B;&#x4F5C;&#x8005; &#x4E45;&#x4E45;&#x5348;&#x591C;&#x65E0;&#x7801;&#x9C81;&#x4E1D;&#x7247;&#x79CB;&#x971E;&#x6D88;&#x9632;&#x6813; &#x6700;&#x65B0;&#x7CBE;&#x54C1;&#x56FD;&#x5077;&#x81EA;&#x4EA7;&#x5728;&#x7EBF;&#x7F8E;&#x5973;&#x8DB3;&#x64C1;&#x6709;&#x6D77;&#x91CF;&#x7684;&#x5F71;&#x8996;&#x8CC7;&#x6E90; &#x4E9A;&#x6D32;&#x6210;a&#x4EBA;&#x65E0;&#x7801;&#x4E9A;&#x6D32;&#x6210;a&#x65E0;&#x7801;&#x7279;&#x9EC4;APP &#x89C6;&#x9891;&#x4E00;&#x533A;&#x4E8C;&#x533A;&#x89C6;&#x9891;&#x5728;&#x7EBF;&#x89C2;&#x770B;&#x89C6;&#x9891; &#x4E9A;&#x6D32;&#x514D;&#x8D39;&#x89C6;&#x9891;&#x5728;&#x7EBF;&#x89C2;&#x770B;&#x6211;&#x5011;&#x6BCF;&#x5929;&#x5C07;&#x70BA;&#x60A8;&#x66F4;&#x65B0;&#x5F71;&#x8996; 99&#x4E45;&#x4E45;&#x514D;&#x8D39;&#x7CBE;&#x54C1;&#x9AD8;&#x6E05;&#x7279;&#x8272;&#x5927;&#x7247;&#x5EE3;&#x5927;&#x7DB2;&#x53CB;&#x6700;&#x65B0; 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