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        基于溫度的藥品凍融操作過(guò)程表征

        更新時(shí)間:2024-11-22   點(diǎn)擊次數:456次


        基于溫度的藥品凍融操作過(guò)程表征

         

        在生物制藥生產(chǎn)過(guò)程中,凍融操作用于確保長(cháng)時(shí)間保存期間產(chǎn)品的完整性,但它們也會(huì )引入額外的壓力,例如可能導致蛋白質(zhì)活性喪失的冷凍濃度梯度。 應對不同規模的凍融操作進(jìn)行工藝表征,并注意冷凍時(shí)間和邊界效應,以確保產(chǎn)品在整個(gè)工藝和工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中的穩定性。 目前,過(guò)程表征通常依賴(lài)于一個(gè)或很少的溫度探頭,這些探頭根據原始溫度檢測凝固時(shí)間,而原始溫度在很大程度上受到濃縮溶液冰點(diǎn)降低的影響。 為了克服這個(gè)問(wèn)題,提出了一種基于光纖布拉格光柵傳感器溫度測量的二階導數來(lái)檢測結冰的方法。 該方法的適用性通過(guò)使用純化水和濃縮制劑的冷凍時(shí)間來(lái)最小化邊界效應的新型小型凍裝置的過(guò)程表征來(lái)證明。 對于 -60 至 -20℃ 的溫度,冷凍時(shí)間從 35 分鐘到 81 分鐘不等,并影響冷凍濃度曲線(xiàn)。 此外,基于普朗克方程的凍結時(shí)間估計揭示了由于啟動(dòng)溫度梯度而導致的模型局限性,這可以通過(guò)經(jīng)驗擴展的普朗克模型來(lái)糾正。 作為假設,我們得出的結論是,從冷凍濃度的角度來(lái)看,冷凍溫度對于冷凍袋等特征冷凍距離較小的容器來(lái)說(shuō)不太重要。 使用二維解析溫度曲線(xiàn),當冷凍溫度高于 -30℃ 時(shí),觀(guān)察到最后一個(gè)冷凍點(diǎn)從容器頂部到底部的移動(dòng)。

         

        關(guān)鍵詞:凍融,過(guò)程表征,冷凍時(shí)間,配方,最后冷凍點(diǎn)

         

        介紹

        治療性蛋白質(zhì)是暢銷(xiāo)的藥物之一。 由于其高價(jià)值和生產(chǎn)成本,活性藥物成分 (API) 在運輸和儲存過(guò)程中的活性損失必須通過(guò)選擇合適的制劑試劑來(lái)限制 (Chang et al., 2005; Bauer et al., 2017)和儲存 狀況。 因此,許多生物藥品都以冷凍狀態(tài)儲存(Singh et al.,2009;Authelin et al., 雖然冷凍會(huì )減慢并減少 API 的降解反應,但冷凍過(guò)程會(huì )使蛋白質(zhì)面臨不同的壓力,例如冷變性(Privalov,1990)、冷凍濃縮(Bhatnagar et al., 2007)、冰晶形成(Chang et al., 1996),以及潛在的賦形劑結晶。 蛋白質(zhì)活性損失或聚集與冷凍濃度相關(guān)(Reinsch et al.,2015;Roessl et al.,2015)。 在微觀(guān)尺度上,水分子的結晶導致冰晶結構內剩余溶質(zhì)的凍結濃縮,從而導致蛋白質(zhì)的凍結溫度依賴(lài)性相行為(W?ll et al.,2019a,b)。 在大規模冷凍操作中,宏觀(guān)冷凍濃縮導致溶質(zhì)分布不均勻。 在冷凍較大體積的過(guò)程中,冰鋒從冷卻的容器壁向容器的中心前進(jìn)。 冷凍時(shí),溶質(zhì)濃縮在相邊界前面并在固相和液相之間分配(Bhatnagar et al.,2007),導致宏觀(guān)冷凍濃縮。 此外,由于密度梯度,這種冷凍濃縮效應會(huì )導致自然對流(Butler,2002),從而導致溶質(zhì)沉降。 因此,隨著(zhù)凍結前沿的出現,峰值濃度出現在凍結體中心底部的非典型凍結濃度分布是不可避免的(Maity et al.,2009;Kolhe and Badkar,2011;Roessl et al.,2014; Reinsch et al.,2015)。

         

        縮寫(xiě):LPTF,最后一個(gè)凍結點(diǎn); PTFE、聚四氟乙烯; RMSE,均方根誤差; TRIS,三-(羥甲基)-氨基甲烷

         

        研究表明,冷凍濃度取決于冷凍過(guò)程而不是儲存溫度(Hauptmann et al.,2019)。 然而,缺少以傳熱和相變?yōu)橹攸c(diǎn)的凍融特性研究(Fan et al., 2018),但對于確保工藝可擴展性并允許在理想冷凍溫度方面進(jìn)行工藝優(yōu)化是必要的。 經(jīng)常用于表征凍結過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵參數是冰鋒速度,它影響最大凍結濃度(Webb et al.,2002;Rodrigues et al., 2011;Hauptmann et al., 2019)和總凍結時(shí)間。 凍結時(shí)間的確定通?;谧詈髢鼋Y點(diǎn) (LPTF) 的粗略溫度測量,其中冰鋒在凍結過(guò)程結束時(shí)聚集在一起。 該計算依賴(lài)于冰低于冰點(diǎn)溫度的假設,由于冰點(diǎn)降低發(fā)生在高度濃縮的環(huán)境中,冰點(diǎn)溫度通常在 -0.5 (Rodrigues et al., 2011) 到 -5℃ (Lashmar et al., 2007) 之間任意設定。 解決方案。 此外,溫度探頭必須準確位于 LPTF 位置。 尚未提出一種獨立于凝固點(diǎn)降低和 LPTF 位置來(lái)確定凝固時(shí)間的方法。 在最近的一篇出版物中,建議使用 Plank 方程來(lái)模擬制藥過(guò)程的總冷凍時(shí)間(Authelin et al.,2020),從而可以預測和優(yōu)化過(guò)程時(shí)間。 然而,迄今為止,藥物冷凍過(guò)程中的模型驗證還缺失(Authelin et al.,2020)。

        In the following work,a derivative-based temperature analysis for the detection of the total freezing time is presented. This method is used for process characterization of a novel small- scale freeze-thaw model with regards to freezing times at different temperatures. The applicability of the Plank equation on actively cooled pharmaceutical freezing processes is discussed to improve transferability of freezing processes to different scales and freezing setups. An extension of the Plank equation is introduced for correction of transient start-up conditions.

        在接下來(lái)的工作中,提出了一種基于導數的溫度分析來(lái)檢測總凍結時(shí)間。 該方法用于對新型小規模凍融模型在不同溫度下的冷凍時(shí)間進(jìn)行過(guò)程表征。 討論了普朗克方程在主動(dòng)冷卻藥物冷凍過(guò)程中的適用性,以提高冷凍過(guò)程到不同規模和冷凍裝置的可轉移性。 引入普朗克方程的擴展來(lái)校正瞬態(tài)啟動(dòng)條件。

         

        材料和方法

        樣品制備

        所有使用的溶液均用超純水(PURELAB Ultra、ELGA LabWater、Veolia Water Technologies,Saint-Maurice,France)制備,并在使用前使用 0.2 mm 過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。 由于 Tris-(羥甲基)-氨基甲烷 (TRIS) 緩沖液是蛋白質(zhì)制劑中廣泛使用的緩沖液(Zbacnik  et al., 2017),TRIS 緩沖液由購自 Merck(達姆施塔特,德國)的 TRIS 和 Tris-(羥甲基)- 制備而成。 氨基甲烷鹽酸鹽購自 AppliChem(達姆施塔特,德國),濃度為 500 mM。 使用鹽酸將pH調節至pH 7.5±0.1。 選擇具有單一成分的溶液以減少成分相互作用,并選擇較高的濃度以更好地與通常冷凍運輸的高濃度藥物制劑進(jìn)行比較。 此外,凝固點(diǎn)降低取決于溶質(zhì)濃度,這強調需要新的總凝固時(shí)間計算方法。 對于蛋白質(zhì)和穩定糖等不同的溶質(zhì),預計會(huì )產(chǎn)生類(lèi)似的濃度效應(Rodrigues et al.,2011)。

         

        新型小型凍融裝置

        與德國施韋青根 Bilfinger Industrietechnik Salzburg GmbH 共同設計和制造了一種新型小型凍融裝置。 它被設計為工業(yè)規模冷凍裝置的縮小模型,代表較大中空管的切片。 如圖 1 所示,中空圓柱形冷凍裝置由外冷卻套和內冷卻管冷卻,而底部單獨加熱,以最大限度地減少縮小邊界效應。 容器體積被聚四氟乙烯 (PTFE) 制成的鑲嵌物分為六個(gè)單獨的室。 該嵌體允許在每個(gè)室高達 90 mL 的工作體積下執行最多六個(gè)單獨的實(shí)驗。 此外,由于導熱率低,PTFE 還可以平衡腔室底部的熱通量,從而產(chǎn)生如圖 1 橫截面所示的溫度分布。該 PTFE 底部抵消了由于鋼的導熱性而出現的邊界效應 墻壁。 外冷卻壁和內冷卻壁由 3 毫米厚的 316L 不銹鋼制成,半徑分別為 38 毫米和 100 毫米。 腔室深度為 40 毫米。 所有管道和鋼制部件均使用 Armacell(德國明斯特)的 20 mm Armaflex 進(jìn)行絕緣。

        凍融裝置的管道和儀表圖如圖 1 所示。為了達到所需的溫度,裝置的內部和外部冷卻回路合并并連接到帶有冷卻液 Kryo 的低溫裝置 Integral XT 1590 90,均購自 Lauda(Lauda-K?nigshofen,德國)。 安裝了 Krohne(德國杜伊斯堡)流量計、針閥和 2 bar 的設定系統壓力,在內回路和外回路中實(shí)現了 25 ± 5 L/min 的冷卻液流量。 容器底部由冷卻裝置 F25-MC 和冷卻液 Thermal HY 加熱,兩者均購自 Julabo(德國 Seelbach)。 在初步研究中,當冷凍雙去離子水時(shí),發(fā)現 0℃ 的恒定底部溫度對于容器中平行冷凍前沿所指示的最小邊界效應是理想的(數據未顯示)。 所有裝置均以最大功率運行,沒(méi)有任何設定的溫度梯度。 連接到 Ahlborn(Holzkirchen,德國)數據記錄器 ALMEMO 8590 的 PT100 熱電偶在線(xiàn)測量分流前凍融裝置入口處以及內回路和外回路兩個(gè)出口流處的冷卻液溫度。 該設置允許設定溫度為 -60 至 30℃。 使用 Mathworks(美國馬薩諸塞州納蒂克)使用 MATLAB App Designer 設計的自定義應用程序收集和控制測量數據。 該應用程序自動(dòng)從數據記錄器、兩個(gè)冷卻裝置和上述樣品溫度裝置在線(xiàn)收集和設置所有溫度數據。 在下面的章節中,冷卻溫度Tcooling是指Kryo 90冷卻單元的溫度,而所有實(shí)驗的底部溫度均設置為0℃恒溫。 流體溫度T是指在低溫裝置入口處測得的溫度。 設定溫度Tset是冷卻后在冷卻單元(Tcooling)中達到的溫度。

         

        圖 1 | 實(shí)驗裝置。 顯示了帶有兩個(gè)單獨的冷卻單元來(lái)控制冷凍室的低溫裝置的管道和儀表圖。 冷凍室可視化為小型凍融裝置的橫截面。 冷卻液和 PTFE 嵌體的溫度分別用藍色到紅色從 Tset 到 0℃ 的梯度表示。 在橫截面內部,樣品溫度探頭和尺寸(以毫米為單位)顯示為白色彎曲鋼封裝上的灰點(diǎn)。 管道由箭頭表示。 陰影區域表示實(shí)心不銹鋼和 PTFE。

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        在進(jìn)行實(shí)驗之前,使用 Otto-chemie(德國弗里多芬)的食品級硅膠 Ottoseal S27 密封 PTFE 嵌體和外殼之間的間隙。 對于每個(gè)實(shí)驗,將 90 mL 樣品移入腔室中。 相鄰的室充滿(mǎn)超純水,以盡量減少徑向邊界效應。 冷凍過(guò)程開(kāi)始時(shí)在 5℃ 下保持至少 2 小時(shí),以確保平衡起始條件。 平衡后,在最大冷卻坡度下將設定溫度調整為-60 至-20℃。 當所有樣品溫度傳感器測得溫度低于-1℃后,底部加熱裝置自動(dòng)關(guān)閉以達到低樣品溫度。 如果采取冷凍樣品,則在冷凍后增加 2 小時(shí)的保持時(shí)間,以確保冷凍過(guò)程處于平衡。 冷凍步驟后,通過(guò)將溫度設置為30℃至少1小時(shí)來(lái)開(kāi)始解凍。 不同階段的計時(shí)是使用上述應用程序自動(dòng)完成的。

         

        溫度評估

        使用 14 個(gè)溫度傳感器監測樣品溫度,如圖 1 所示,并提供探頭坐標信息。 傳感器位于 Loptek(德國柏林)定制設計的兩根預先校準的光纖溫度光纖上,以及來(lái)自 Sylex(斯洛伐克布拉迪斯拉發(fā))的詢(xún)問(wèn)器 SCN-46 S-line Scan 416。 這些光纖被直徑為 1 毫米的不銹鋼管封裝,并包含多達九個(gè)光纖布拉格光柵傳感器。 一根帶有六個(gè)傳感器的光纖位于樣品表面下方 5 毫米處,另一根帶有八個(gè)傳感器的光纖位于腔室地面上方 5 毫米處,以實(shí)現腔室橫截面的二維解析溫度場(chǎng)。 使用 Sylex(斯洛伐克布拉迪斯拉發(fā))的 S-line Sentinel 軟件每 2 秒獲取一次溫度數據。 與常用的熱電偶相比,所使用的溫度監測裝置具有提高溫度分辨率的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)減少通過(guò)傳感器電纜的熱傳導。 我們預計沿傳感器的熱傳導不會(huì )影響冷凍過(guò)程,因為與周?chē)谋退啾龋? 毫米厚的中空管的熱容量可以忽略不計。

         

        圖 2 | 過(guò)程溫度評估示例。 (A) 顯示測量的器件溫度 Tout、T∞ 和 T Cool 以及 13 個(gè)樣本溫度中的 5 個(gè)。 菱形表示冷卻時(shí)間,三角形表示單個(gè)探針處的凍結,六邊形表示 LPTF。

        各個(gè)探針處的凍結和 LPTF 時(shí)間是根據樣本數據二階導數的最小值計算的,如面板 (B) 所示。 r表示溫度探頭距冷卻表面的距離增加。 各個(gè)樣品溫度曲線(xiàn)在面板 (B) 中進(jìn)行了著(zhù)色,以提高可見(jiàn)性。

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        查看如圖 2A 所示的典型樣品溫度曲線(xiàn),可以檢測到兩個(gè)不同的相變時(shí)間。 第一個(gè)轉變發(fā)生在觀(guān)察到的溫度探針處凍結時(shí),其中溫度降至熔點(diǎn)以下,稱(chēng)為部分凍結時(shí)間。 此時(shí),熱力學(xué)性質(zhì)從水變?yōu)楸?,導致溫度斜率發(fā)生明顯變化。 第二個(gè)事件表示 LPTF 凍結,稱(chēng)為總凍結時(shí)間。 當整個(gè)塊體被冷凍時(shí),不再釋放潛熱,因此所有探頭的溫度將同時(shí)降低。 為了分析每個(gè)溫度探頭測量的兩次時(shí)間,使用 Savitzky-Golay 濾波器對溫度曲線(xiàn)進(jìn)行平滑和導出兩次,并使用二階多項式和 151 個(gè)數據點(diǎn)的窗口。 二階導數的最小值表示所討論的斜率變化。 應根據稍后討論的數據質(zhì)量仔細選擇濾波器窗口,其中較小的窗口會(huì )導致更高的精度,但也會(huì )導致更高的信噪比。 凍結時(shí)間是根據所有 14 個(gè)溫度測量值計算的,并刪除了基于三個(gè)縮放中值絕對偏差的異常值,以提高計算的穩健性。 然而,由于所用光纖傳感器的信噪比較低,部分凍結時(shí)間是根據低于 -2的溫度確定的。 當將該方法應用于熱電偶的溫度讀數時(shí),可以基于具有較小薩維茨基-戈萊過(guò)濾器窗口的二階導數來(lái)分析部分和總凍結時(shí)間。

        根據設定溫度的低溫度計算直到冷卻液達到設定溫度的冷卻時(shí)間。

         

        結冰時(shí)間預測

        計算總凍結時(shí)間 tfreezing 的 Plank 模型(Plank,1913)由 Authelin 等人提出。 (2020)作為藥物冷凍過(guò)程的模型。 它假設冷卻流體溫度 Tcooling 從平衡逐步降低到設定溫度,并且在凍結之前主體處于熔化溫度 Tm。 方程可以寫(xiě)成

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        其中ρl是液體樣品的密度,Δhm是熔化潛熱,X是LPTF和傳熱表面之間的特征距離(Pham,2005)。 對于無(wú)限板,幾何因子 E 為 1,對于無(wú)限圓柱體,幾何因子 E 為 2,對于球體,幾何因子 E 為 3。 比奧數 Bi = kaX/λs 將殼的傳熱阻力 ka 與給定導熱系數 λs 的樣品的內部導熱阻力聯(lián)系起來(lái)(Martin,2010)。 對于藥物溶液,可以在稀釋溶液的假設下使用固體水作為溶劑的物理性質(zhì)(Randall and Rossini, 1929; Kumano et al., 2007)。 假設平衡溫度和熔化溫度之間的溫差可以忽略不計,并且壁溫等于 T∞(Bi→∞),這對于主動(dòng)冷卻的冷凍系統來(lái)說(shuō)可能是這樣,則冷凍時(shí)間可以使用方程 2 來(lái)計算。

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        其中 oC·min 中的 β 是 ρl 、Δhm、X2 、λs 和 E 的函數,總結了給定主動(dòng)冷凍系統的所有常數值。

        冷凍散裝分析

        使用來(lái)自 Bürkle(德國巴特貝林根)的內徑為 8 毫米的空心鉆頭從冷凍塊中取樣。 將一個(gè) 3D 打印支架放置在腔室頂部,該支架以 10.5o 的角度分布在兩排不同的行中,具有 9 個(gè)鉆孔,從而在整個(gè)腔室長(cháng)度上提供可重復的鉆孔位置。 在徑向邊界效應可忽略不計的假設下,從具有重疊樣本體積的兩個(gè)不同行進(jìn)行采樣提高了橫截面的樣本分辨率,如圖 1 中的實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)所示。 從三層 8 毫米高的鉆孔中取樣,最后一個(gè)孔距室底部 2 毫米。 始終丟棄高于第一樣品水平的樣品,以避免吸收先前鉆孔和測量來(lái)自腔室中心的冷凍濃縮液體的冰碎片,該冰碎片被推出膨脹的冰鋒相遇的地方。 將樣品轉移至來(lái)自 Eppendorf(德國漢堡)的 2 mL 反應管中并在室溫下解凍。 使用來(lái)自Radiometer Analytical SAS(法國里昂)的電導率計CDM 230通過(guò)電導率分析來(lái)測量樣品的緩沖液濃度。

         

        結果

        凍結時(shí)間分析

        為了表征和描述冷凍過(guò)程,總冷凍時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵的過(guò)程參數。 總凍結時(shí)間可以根據二階導數計算出來(lái),如圖 2 所示。雖然總凍結時(shí)間的最小值很明顯,但部分凍結時(shí)間的最小值則不然。 當冷凍溫度高于-25℃時(shí),由于溫度傳感器的信噪比較低,所有溫度探頭都無(wú)法正確檢測到第一個(gè)最小值。 因此,當溫度低于 -2℃ 時(shí)確定部分凍結時(shí)間。通過(guò)各個(gè)探頭的凍結時(shí)間,可以監測室內冰鋒進(jìn)展,如圖 3 所示。根據二階導數計算的總凍結時(shí)間 所有溫度曲線(xiàn)的結果是純水樣品的標準偏差低于 2%,高濃度緩沖液樣品的標準偏差低于 4%。 查看圖 2A 中所示的觀(guān)察到的過(guò)程溫度,由于溫度調節,冷卻溫度超過(guò)設定溫度最多 3 K,而由于鋼外殼的熱容量,流體溫度卻沒(méi)有超過(guò)設定溫度。

         

        過(guò)程表征

        純化水在不同溫度下冷凍,以表征新型凍融裝置的傳熱性能,因為它可用于大規模工藝表征。在我們的研究中,當設定溫度從-20℃降低到-60℃時(shí),水樣的總冷凍時(shí)間縮短了2.3倍,從78.7分鐘縮短到33.8分鐘,如圖4所示。與在較低冷卻溫度下幾乎停滯的冷凍時(shí)間減少相比,在較高冷卻溫度下冷凍時(shí)間縮短得更快?;诜匠?,使用-25至-20℃的數據擬合了估算模型,得出β值為1619 C·min,R2=0.972。用-20℃下的數據求解方程2,得到β=1620 C·min。計算出模型和所有設定溫度的均方根誤差(RMSE)為1.83分鐘,其中在-25℃以下的溫度下測量的冷凍時(shí)間總是超過(guò)估計的冷凍時(shí)間。根據方程3計算冷卻時(shí)間與總冷凍時(shí)間的比值Ⅱ。從總冷凍時(shí)間中減去經(jīng)驗確定的17.3倍Ⅱ,RMSE降低到0.96分鐘,特別是在較低溫度下冷凍時(shí)間的估計得到了改進(jìn),如圖4所示。

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        分析冷卻裝置內傳熱流體的溫度,測得設定溫度為—30℃及以上時(shí)冷卻時(shí)間為4.2-4.9分鐘。 對于較低的設定溫度,冷卻時(shí)間大大增加。 冷凍過(guò)程開(kāi)始后,冷卻液與低溫裝置出口之間的溫差高達 3 K,在平衡狀態(tài)下降至 0.5 K 左右。 使用供應商提供的傳熱流體的平均熱容為 1.5 kJ/kg/K、密度為 900 kg/m3、流量為 25 L/min,可估計功率損耗為 330 至 100 W 處于平衡狀態(tài)。

         

        樣品溫度

        在溫度纖維的幫助下,可以觀(guān)察到連續的二維解析溫度場(chǎng),如圖3所示。假設冷凍樣品的溫度低于-2℃,則在冷凍過(guò)程中可以觀(guān)察到冰鋒進(jìn)展。 當冷凍 500 mM Tris 緩沖溶液時(shí),觀(guān)察到垂直冷凍前沿,如圖 3A 所示。 在所有實(shí)驗中,LPTF 都是在距內冷卻壁 26.5 ± 2.5 mm 的距離處觀(guān)察到的。 相反,LPTF 的垂直位置隨溫度變化,如圖 3B 所示。 在設定溫度低于-25°C的實(shí)驗中,冷凍前沿首先在容器底部相遇,并且從容器底部到頂部有一個(gè)小間隙結冰,導致LPTF位置位于室的頂部。 當水分子的膨脹將液體推向主體表面時(shí),就會(huì )發(fā)生這種情況,這與在 LPTF 位置處的樣品主體頂部觀(guān)察到的冰山一致。 在-25℃及以上的高溫設定下冷凍會(huì )導致容器底部出現LPTF位置,其中剩余的液體以收縮鐘的形式凍結。 圖 3C 顯示了基于溫度的容器頂部和底部的總冷凍時(shí)間與根據溫度斜率計算的總冷凍時(shí)間的比較。 基于斜率的冷凍時(shí)間與圖 2 所示的純化水觀(guān)察到的相似。當設定溫度低于 -25℃ 時(shí),冷凍容器頂部和底部的冷凍時(shí)間差異微乎其微,而在設定溫度下冷凍容器頂部和底部的冷凍時(shí)間差異高達 9.7 分鐘。 更高的設定溫度。

         

        冷凍散裝分析

        將 pH 7.5 的 500 mM Tris 緩沖溶液在 -20、-40 和 -60℃ 下冷凍,以評估冷凍溫度對冷凍濃度的影響,結果如圖 5 所示。

        在所有冷凍實(shí)驗中,最大冷凍集中區域位于距離內冷卻壁25mm的LPTF位置。 當溫度從-60℃升高到-40℃再升高到-20℃時(shí),最大冷凍濃度增量(cmax/c0)分別從1.39±0.01上升到1.52±0.03到2.53±0.04。 體積不均勻性,更具體地說(shuō)是最大濃度與最小濃度的比率 (c max/cmin ),總結了冷凍濃度結果,高值代表高冷凍濃度。 當冷凍溫度為-20、-40和-60 ℃時(shí),將冷凍溫度分別從8.1倍降低到3.6倍到3.0倍,體積不均勻性顯著(zhù)改善。 一般來(lái)說(shuō),觀(guān)察到存在從上到下的濃度梯度。 作者想提一下,采樣方法僅提供樣品體積的平均濃度,而真正的局部峰值冷凍濃度預計會(huì )更高。

         

        圖 3 | 腔室橫截面的二維解析溫度分析。 (A) 顯示插值溫度數據,其中溫度探頭由矩形表示。 在下圖中,低于 –1℃ 和高于 –1℃ 的溫度分別用藍色和紅色突出顯示。 面板 (B) 顯示了 LPTF 之前的 –45 和 –20℃ 的突出溫度。 (C) 不同設定溫度下底部和頂部溫度傳感器的各個(gè)凍結時(shí)間的比較。 由溫度斜率確定的 LPTF 時(shí)間繪制為條形圖以供參考。

        img6 

         

        圖 4 | 不同設定溫度下的冷凍和冷卻時(shí)間。 用星號標記的數據點(diǎn)用于根據方程校準模型。 2,β = 1619,其中灰色區域顯示 95% 置信界限。

        img7 

        討論

        凍結時(shí)間分析

        我們演示了一種從溫度探頭各個(gè)位置提取凍結時(shí)間以及從各種溫度曲線(xiàn)的二階導數中提取總凍結時(shí)間的方法。 單個(gè)探針凍結檢測中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是冰點(diǎn)降低,這會(huì )導致諸如低于 -5℃ 的固態(tài)等假設(Lashmar 等,2007)。 此外,基于原始溫度分布的總凍結時(shí)間的檢測依賴(lài)于 LPTF 位置的知識。 我們通過(guò)使用溫度二階導數的方法克服了這兩個(gè)問(wèn)題。 然而,該方法依賴(lài)于冷凍溫度和平衡溫度差異較大的精確和高頻數據。 隨著(zhù)冷凍溫度升高,由于絕對溫度梯度降低,信噪比降低。 因此,冷凍時(shí)間的標準偏差隨著(zhù)冷凍溫度的升高而增加。 因此,通過(guò)斜率分析僅計算 LPTF 凍結時(shí)間。 用于計算容器頂部和底部冷凍時(shí)間的單獨冷凍時(shí)間假設溫度低于-2℃。

        比較兩種方法(如圖 3C 所示)揭示了兩種方法的偏差。 雖然基于導數的分析顯示出與純化水類(lèi)似的趨勢,但基于溫度的分析通常會(huì )導致與預期冷凍時(shí)間的較大偏差。 盡管如此,基于溫度的分析能夠表明 LPTF 沉降到腔室的地面上,如下文所述。 當使用單個(gè)熱電偶設計冷凍過(guò)程時(shí),這一點(diǎn)非常重要,因為這應該針對 LPTF。 不幸的是,與普通熱電偶相比,光纖溫度傳感器的信噪比通常較低。 然而,這顯示了基于導數的方法的適用性和穩健性。

         

        普朗克方程的推廣

        如上所示,冷凍溫度的降低如預期縮短了總冷凍時(shí)間。 正如我們基于普朗克模型的模型所示,冷凍過(guò)程的熱力學(xué)特性可以部分解釋非線(xiàn)性趨勢。 基于三個(gè)初始水凍結測試的計算模型能夠估計較低溫度下的總凍結時(shí)間。

        然而,隨著(zhù)冷凍溫度的降低,我們的實(shí)驗結果與普朗克模型的偏差更大。 這些偏差顯示了普朗克方程與過(guò)程相關(guān)的局限性。 與我們的模型不同,根據所有測量數據的指數外推,對于較低的冷凍溫度,測量值預計接近約 31 分鐘的最短冷凍時(shí)間。 由于普朗克方程僅適用于階梯式冷卻溫度,因此隨著(zhù)溫度降低而增加的冷卻時(shí)間可以解釋實(shí)際凍結時(shí)間的有限行為。

         

        圖 5 | 對溫度范圍為 –60 至 –20℃ 的冷凍鉆芯進(jìn)行離線(xiàn)樣品分析。 樣品體積在第一張圖中以實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)矩形顯示,其中測量的中心用 x 標記。 標準化濃度通過(guò)從藍色到紅色的顏色梯度來(lái)可視化,并插值在三次重復的平均值之間 (n = 3)。

        2e1780ebb5ada1c8a1d8477c1784b81 

        因此,引入無(wú)量綱數Ⅱ來(lái)考慮冷凍裝置的瞬態(tài)啟動(dòng)條件。 對于理想系統,隨著(zhù)冷卻溫度逐步降低,II 接近 0,而在實(shí)際系統中,由于冷卻裝置中物理傳熱的限制,II 預計會(huì )隨著(zhù)冷凍溫度的降低而增加。 如果超過(guò) 1,則降低設定冷卻溫度不會(huì )導致冷卻時(shí)間進(jìn)一步減少,因為初始瞬態(tài)期超過(guò)凍結時(shí)間。 因此,溶質(zhì)的低溫濃度也不會(huì )降低。 表 1 總結了我們設置的 Ⅱ 值。在較低設定溫度下,隨著(zhù)需要從冷卻液中去除更多的熱函并且冷卻裝置在較低溫度下效率降低,Ⅱ 會(huì )隨著(zhù)冷卻時(shí)間的增加而增加。

         

        TABLE 1 | values of the freezing device.表 1 | 冷凍裝置的Ⅱ值。

         

        Tset

        /%

        60.0

        46:6 ± 0:41

        50.0

        31:8 ± 0:16

        40.0

        19:2 ± 0:44

        30.0

        8:8 ± 0:06

        25.0

        6:4 ± 0:02

        22.5

        6:0 ± 0:10

        20.0

        5:4 ± 0:08

         

        通過(guò)計算出的 Ⅱ 值對凍結時(shí)間進(jìn)行經(jīng)驗修正,顯著(zhù)改進(jìn)了模型。 因此,我們得出結論,當考慮瞬態(tài)啟動(dòng)條件時(shí),即使在低溫下,普朗克方程也可以用于預測凍結時(shí)間。 此外,在進(jìn)行結垢實(shí)驗或比較不同凍融過(guò)程時(shí),Ⅱ尤其重要。 一般來(lái)說(shuō),由于總冷凍時(shí)間短,對于冷凍袋等小冷凍距離容器來(lái)說(shuō),II 級被認為是最高的。 另一方面,被動(dòng)冷卻系統,如凍融瓶,由于其階梯式冷卻溫度下降和較長(cháng)的冷凍時(shí)間,將具有低的Ⅱ值。 因此,作者得出結論,從低溫濃縮的角度來(lái)看,冷凍溫度對于冷凍時(shí)間較長(cháng)的系統(例如被動(dòng)冷卻系統和冷卻容器)非常重要,Nidhi 等人也表明了這一點(diǎn)(Miller et al., 2013)。 相反,降低快速冷凍過(guò)程中的設定溫度可能只能略微改善整體均勻性和蛋白質(zhì)完整性,正如有關(guān)一次性袋凍融過(guò)程的報道(Kolhe et al., 2012; Le Saout et al.,2012;

        作為一個(gè)應用示例,Plank 模型可用于在監管機構面前證明經(jīng)過(guò)驗證的可接受范圍的合理性,其中較低的冷凍溫度會(huì )導致更廣泛的可接受范圍,從而實(shí)現更穩健的過(guò)程。

         

        樣品溫度

        在我們的設置中觀(guān)察到的冷凍過(guò)程中平行、垂直的冷凍前沿為我們的工藝的可擴展性提供了有價(jià)值的信息。 它強調了我們的設置中存在的最小邊界效應,這對于小規模模型至關(guān)重要。 在邊界效應不受控制的小規模過(guò)程中,例如瓶子中的被動(dòng)冷凍,會(huì )發(fā)生從底部的冷凍,這可能會(huì )影響冷凍前沿形狀和最終濃度分布,如 Kolhe 和 Badkar (2011) 所見(jiàn),其中底部濃度通常較低 比上面的層。 在使用主動(dòng)冷卻系統的研究中,尚未描述邊界效應。

        觀(guān)察到的另一個(gè)現象是,LPTF 距離內冷卻壁更近,這是由于內壁傳熱面積較小的結果。 從內冷卻壁到 LPTF 的體積以及從外冷卻壁到 LPTF 的體積之間的簡(jiǎn)化能量平衡(參見(jiàn)補充材料)導致 LPTF 到內壁的理論距離為 24 mm,這與我們的研究結果一致。

        當在高溫下冷凍時(shí),LPTF 明顯下降到室的底部,這可以通過(guò)整個(gè)過(guò)程中冷凍濃縮液體的沉降來(lái)解釋(Singh and Nema, 2010; Kolhe and Badkar, 2011)。 濃溶液推至 LPTF 頂部與 Hauptmann 等人的結果一致。 (2019)。 冷凍濃度導致溶液中產(chǎn)生粘度和密度梯度,從而引起自然對流(Butler,2002)。 此外,隨著(zhù)濃度的增加,冰點(diǎn)會(huì )降低。 因此,當冷凍濃度在升高的冷凍溫度下時(shí),LPTF 位置將下沉到底部。 由于對流增加(Authelin 等人,2020)和更大的沉降距離,這種效應在大規模應用中可能更加明顯。 通常在 LPTF 處放置溫度探頭以進(jìn)行過(guò)程監控(Lashmar et al., 2007; Le Saout et al., 2012),這可能會(huì )在冷凍不同配方時(shí)導致錯誤結果。 因此,我們建議使用上面討論的基于導數的方法來(lái)基于冷凍時(shí)間進(jìn)行過(guò)程表征,因為該方法在容器中溫度探頭的位置方面具有靈活性。

         

        冷凍散裝分析

        一般來(lái)說(shuō),我們的發(fā)現濃度最大值高達 2.5 倍,與主動(dòng)冷卻冷凍裝置的文獻一致2002; Rodrigues et al., 2011; Reinsch et al., 2015),他們報道了 1.3 至 2.5 -倍冷凍濃度。 觀(guān)察到的濃度梯度可以通過(guò)溶質(zhì)排除導致的冷凍濃縮來(lái)解釋(Roessl et al., 2014; Authelin et al.,2020)和前面提到的較稠密冷凍濃縮物的沉降(Kolhe and Badkar,2011)。 在較低的冷凍溫度下將溫度降低 20℃ 時(shí),體積均勻性的降低幅度較小,這可以歸因于普朗克模型所見(jiàn)的物理限制,在較低溫度下冷凍時(shí)間的縮短幅度較小。 這支持了我們的發(fā)現,即冷凍濃度和冷凍過(guò)程可以通過(guò)冷凍時(shí)間來(lái)表征,這與 Hauptmann 等人(2019)的觀(guān)點(diǎn)一致。

        結論

        所提出的結果為凍融過(guò)程設計和監測提供了工業(yè)相關(guān)指導。 展示了一種使用兩個(gè)獨立冷卻回路的新型凍融裝置。 雖然該模型的工程復雜性有所增加,但它能夠減少邊界效應,例如從底部?jì)鼋Y。 因此,可以小規模評估工藝參數,例如 LPTF 的溫度依賴(lài)性沉降,這對于工藝監控非常重要。 此外,將具有過(guò)程干擾的高分辨率溫度監測方法與基于導數的方法相結合來(lái)計算總冷凍時(shí)間。 確定的冷凍時(shí)間對冷凍散裝的冷凍濃度曲線(xiàn)有很大影響。 對于給定的主動(dòng)冷卻系統,可以使用普朗克方程通過(guò)模型校準和少量?jì)鼋Y時(shí)間實(shí)驗來(lái)估計這些凍結時(shí)間。 然而,對于低冷凍溫度下的實(shí)際過(guò)程,普朗克模型必須擴展無(wú)量綱數II,以考慮傳熱流體和系統冷卻期間出現的啟動(dòng)條件。 Ⅱ可以解釋為什么冷凍溫度在短距離冷凍過(guò)程中起著(zhù)更重要的作用。 因此,對于不銹鋼容器中具有較大特征距離的冷凍過(guò)程,冷凍溫度的降低可能對冷凍體積均勻性產(chǎn)生更大的影響。 冷凍距離較短的工藝(例如冷凍袋)可能不會(huì )因低冷凍溫度而得到改善。 因此,這些發(fā)現對制藥行業(yè)凍融操作的未來(lái)過(guò)程分析技術(shù)策略具有重大影響。


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